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小反刍兽疫活疫苗效力评价
发布时间:2014-04-10 14:49作者:songdan来源:

  薛青红,印春生,李宁,支海兵*

  (中国兽医药品监察所 国家牛瘟参考实验室 北京100081)

  摘要:以新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产的6批小反刍兽疫活疫苗为材料,对其进行最小免疫剂量、疫苗免疫期和疫苗保存期的研究。结果显示,该疫苗最小免疫剂量为103TCID50/头份;免疫期至少为26个月,保存期为-20℃保存12个月。结果表明,该疫苗免疫原性好,对山羊和绵羊均可提供良好保护。

  关键词:小反刍兽疫;疫苗;效力;评价

  小反刍兽疫(PPR)又名小反刍兽伪牛瘟,是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、烈性、接触性传染病,易感群发病率高达100%,暴发严重时死亡率达100%。目前该病尚无有效治疗方法,主要通过早期诊断和疫苗免疫进行控制。19世纪40年代该病首次在科特迪瓦报道以来,先后在多个国家暴发和流行。2 007年7月,我国西藏地区先后发生4起PPR疫 情,感染近5000只羊 。西藏地区生活着多种珍稀野生动物,这些动物一旦感染PPR,将造成巨大的损失。

  目前我国在新疆和西藏地区采用疫苗接种的策略进行该疫病的防控,因此,深入开展小反刍兽疫活疫苗的效力研究对该病的预防和控制起着至关重要的作用。本试验拟以新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产的6批小反刍兽疫活疫苗为基础,对其进行最小免疫剂量、疫苗免疫期和疫苗保存期的研究。

  1材料与方法

  1.1生产用毒种 200701批PPR生产用基础毒种,中国兽医药品监察所提供。

  1.2生产用细胞 Vero细胞,代次F151,中国兽医药品监察所提供。

  1.3MEM 细胞培养液GIBICO公司生产(批号:41500-034)。

  1.4试验动物 1岁以上山羊和绵羊。

  1.5其他常规试剂均由中国兽医药品监察所提供。

  1.6疫苗制造 按文献进行疫苗制造和质量检验,生产用基础毒种为200701批PPR毒种;生产用细胞为Vero细胞,代次为F157代;共生产小反刍兽疫活疫苗6批,批号分别为2007002、2007003、2007004、2007005、2007006、2007007 ,由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产,经检验合格的疫苗用于效力研究试验。

  1.7疫苗最小免疫剂量试验 将2007002、2007003、2007004 批疫苗按文献规定的方法测定 PPR 病 毒含量,根据病毒含量测定结果,将其稀释至每毫升 含 104 、103 、1 02 、101TCID 50 。每个剂量经颈部皮下免疫山羊和绵羊各5只,每只羊接种1mL。免疫后21d采血测定血清中PPRV中和抗体效价。

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  1.8疫苗免疫期试验 根据最小免疫剂量试验结果,选取2007005、2007006、2007007批疫苗进行疫苗免疫期试验。将小反刍兽疫活疫苗根据PPR病毒含量检测结果,用稀释液稀释至每毫升含1个免疫剂量(103TCID50/mL),经颈部皮下免疫健康山羊和绵羊,免疫后15个月和26个月分别采血测定小反刍兽疫病毒中和抗体。

  1.9疫苗保存期试验 将2007002、2007003、2007004批疫苗置 -20℃保存15个月后,按文献规定的方法 进行疫苗质量检验。

表1 6批小反刍兽疫活疫苗的质量检验结果

 
 

 

 

  备注:“﹢”表示该项目检验结果为阳性,“-”表示该项目检验结果为阴性;病毒含量测定

  结果为TCID50/头份;效力检验结果为小反刍兽疫病毒中和抗体效价

  2 结果

  2.1 小反刍兽疫活疫苗质量检验结果

  按照文献方法对 2007002、2007003、2007004、2007005、2007006、 2007007 批小反刍兽疫活疫苗进行质量检验,6批小反刍兽疫活疫苗的质量检验结果均达到质量标准,均可用于该疫苗效力研究试验,同时也说明该疫苗生产工艺稳定,批间差异较小,符合大规模生产的要求。

  2.2最小免疫剂量试验结果

  将3批疫苗分别按照104 、103 、102 、101TCID50 /只的剂量免疫试验羊, 每个剂量免疫山羊和绵羊各5只,免疫后21d 采血 测定PPRV中和抗体效价。检测结果表明,免疫 21d 后,各免疫组PPRV中和抗体GMT为15~557之间;对不同种类的免疫羊而言,免疫剂量相同的试 验羊中,山羊GMT显著高于绵羊 GMT;在相同种 类的免疫羊中,03TCID50 /只的免疫剂量可有效刺 激羊体产生高水平的中和抗体,而104TCID 0 /只的免疫剂量可能由于免疫抑制等原因,虽然也能刺激机体产生较高水平的抗体,但与103TCID50/只的免疫剂量相比还有一定差距。以疫苗免疫山羊血清PPRV中和抗体不低于1∶10为标准进行判定,104TCID50/只和102TCID50/只剂量组的平均保护率均为100%,103TCID50/只剂量组的平均保护率均为97%,101TCID50/只剂量组的平均保护率均为80%。根据GMT及不同免疫剂量组的保护率,确定该疫苗的最小免疫剂量为103TCID50/只。各免疫组检测及统计结果见表2~4。

 
 
 

 

 

 

  2.3免疫期试验结果

  免疫后15个月,采集部分免疫羊血液,共78份;免疫后26个月,采集部分免疫羊血液,共105份。按《质量标准》规定的中和试验方法测定PPRV中和抗体。抗体测定结果表明,免疫后15个月,抗体合格率为93.6%;其中免疫山羊的抗体合格率为95%,GMT为1∶272;免疫绵羊的抗体合格率为92.1%,GMT为1∶94.7。免疫后26个月,抗体合格率为85.7%;其中免疫山羊的抗体合格率为87.8%,GMT为1∶194;免疫绵羊的抗体合格率为84.8%,GMT为1∶54.7。PPRV中和效价测定结果及统计见表5、6。

 

 

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  表6 PPR抗体合格率及GMT

 
 

  2.4保存期试验结果 2007002 、2 007003、2007004 批疫苗于-20℃ 保存15个月后,质量检验结果见表7。效力检验结果表明,3批疫苗免疫的15只山羊在免疫后21d血清100% 转阳(≥1∶10),3批疫苗所有 检验项目质量检验结果均符合规定。为确保疫苗质量,确定该疫苗的保存期为-20℃保存12个月。

  表7 3批小反刍兽疫活疫苗-20℃保存15个月后的质量检验结果

 
 

 

 

  3讨论

  小反刍兽疫活疫苗生产用毒株为Nigeria 75/1毒株,该毒株属于PPRV Ⅰ型,通过Vero细胞连续传代后致弱,据资料报道,该毒株可交叉保护其他群毒株的攻击,且无副作用,但对热敏感,稳定性较差。本实验室对该毒株克隆、纯化后进行无菌、安全、病毒含量等检验,建立了符合生产要求的种子批,并用于疫苗生产,所生产疫苗经检验均符合小反刍兽疫活疫苗质量标准。小反刍兽疫为国际兽医局(OIE)规定的A类烈性传染病,对病原操作需要严格的生物安全措施,且目前我国内陆地区尚无该疫病发生的报道,故在国内进行PPRV攻毒保护试验的难度和风险均较大。因此在PPR活疫苗效力评价的研究过程中,采用OIE关于PPR活疫苗效力判定标准进行评价,即健康易感山羊免疫疫苗后21~28d,其血清中和抗体水平100%不低于1∶10为合格。

  最小免疫剂量研究结果表明,除103TCID50/只的免疫剂量组(共15只免疫羊)有 1只免疫羊中和抗体滴度小于1∶10外,其余按102TCID50/只以上剂量免疫的羊,均可产生100%有效保护,且山羊产生的抗体水平显著高于绵羊产生的抗体水平,说明PPR对动物的感染具有品种的倾向性。因PPRV对热敏感,不利于田间运输,为确保免疫效果,将最小免疫剂量确定为103TCID50/头份。本试验未对血清中和抗体小于1∶10的羊进行原因分析,但有研究表明,血清中和抗体滴度小于1:10的免疫羊仍可以抵挡住异源强毒的攻击。

  本试验的免疫期试验结合临床试验进行,与疫苗田间使用情况更为接近,可以更为直观的评价疫苗的实际应用效果。免疫期研究结果表明,按疫苗最小免疫剂量免疫后26个月,抗体合格率仍保持在85%以上,表明该疫苗的免疫期至少为26个月,这与OIE规定PPR活疫苗的免疫期限相一致。该免疫期对多数羊而言为终身免疫,每年只需对新生羊进行补免即可,减少了基层兽医人员的工作强度,确保了疫苗的免疫效果。保存期研究表明,疫苗在-20℃保存15个月后免疫山羊,免疫后28d中和抗体100%大于1∶10,表明该疫苗的保护剂对PPRV提供了良好的保护作用,克服了PPRV稳定性差的问题,确保疫苗稳定、长期、有效保存,最终确定该疫苗保存期为-20℃保存12个月。研究数据表明,该疫苗免疫原性好,免疫期长,对山羊和绵羊均可提供良好保护。

 

 

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