导读：饲料酶制剂应用的新思路、新理念、新技术不断涌现，不同种类动物消化系统的差异性也决定了其酶制剂应用的特殊性和专一性。反刍动物瘤胃发酵与合成特性和饲料原料的复杂性，决定了外源酶制剂在反刍动物日粮中的使用与单胃动物有根本差别，反刍动物酶制剂作用模式的特殊性决定有必要建立反刍动物特异的饲料酶制剂技术体系。本期将特别推出华南农业大学冯定远教授的继构建传统配合技术体系升级版“平衡日粮”新理论后，又提出一个全新的理论和观点——“反刍动物饲料酶制剂作用模式及其技术体系的建立”，为反刍动物酶制剂技术体系提供解决方案，提出的技术体系方案可单独运用，或组合实施，对高产反刍动物特别是高产奶牛产奶前期有明显的应用价值，是对饲料酶制剂应用和研究的又一升华，相信对读者会有更多的帮助和收获。
有关外源性酶制剂对反刍动物作用的研究，始于20世纪60年代（Burroughs等，1960；Rovics等，1962；Rust等，1965），但酶制剂作用效果不稳定。随着发酵成本降低及更多高活性酶制剂问世，促进了外源性酶制剂在反刍动物中的应用有更多的研究（Chen等，1995；Beauchemin 等，1997；McAllister等，1999）。向奶牛日粮中使用的紫花苜蓿茎秆添加酶制剂，产奶量由23.7 kg/d，最高增加到25.6 kg/d，产奶量对酶制剂的反应在产奶前期更明显（McAllister等，2001）。使用木聚糖酶和纤维素酶混合物及单一纤维素酶，分别增加饲喂紫花苜蓿干草或梯牧草干草肉牛的平均日增重30%和36%（Beauchemin等，1995）。在Beauchemin等（2010）的反刍动物用酶的综述文章中总结出的结论是：只有当可消化能是第一限制营养时，添加纤维分解类酶制剂的效果最显著。外源性酶制剂对反刍动物特别是奶牛和肉牛生产性能具有促进作用已经得到证实，但应用结果缺乏一致性。这很正常，单胃动物（猪禽）也是如此，何况更复杂的反刍动物，影响因素多，理论上瘤胃微生物已经具备了所有酶制剂的功能。目前反刍动物的饲料酶制剂应用，仍然采用单胃动物的模式，这是不完善的，基于反刍动物瘤胃的功能和饲料的复杂性，外源酶制剂作用模式有本质的差异，有必要建立反刍动物酶制剂应用的技术体系。
1 添加酶制剂的前提与反刍动物饲料酶的复杂性
饲料酶制剂的研究主要是单胃动物（猪禽）比较多（冯定远，2017），这里讨论的反刍动物酶制剂应用主要是成年动物，在瘤胃发育和微生态功能完善之前的幼年动物如犊牛，基本上可以用单胃动物如猪禽的思路使用酶制剂。近年来，我国也开始重视反刍动物酶制剂的研究与开发（贾仙宝，2009；呼和等，2011；徐学文等，2012；扈添琴，2013；李朝云，2014；解祥学等，2016；林静等，2017；杨泽坤，2017）。在最近的报道中，陈雅坤等（2018）使用宁夏夏盛公司奶牛专用酶（纤维素酶15 000 U/g、木聚糖酶100 000 U/g、葡聚糖酶280 000 U/g、甘露聚糖酶2 500 U/g、果胶酶60 000 U/g、中性蛋白酶2 000 U/g）进行试验，0.15%添加量，泌乳早期奶牛产奶量每天增加4.27 kg。赵连生等（2018）试验同样的采用夏盛奶牛专用酶，提高奶牛饲料转化率、瘤胃发酵指标和产奶量。国外新近反刍用酶报道有Sidique等（2019）、Devant等（2020）、Lourenco等（2020）、Rossow等（2020）、Zayed等（2020）、Abd-Elkerem等（2021）、Azzaz等（2021）、Pech-Cervantes 等（2021）。这些试验结果不一致，有些使用外源酶制剂效果显著，有些没有什么作用。说明了酶制剂应用的复杂性，而反刍动物的瘤胃特性和饲料原料特点更加大了反刍饲料酶的复杂程度。
源于瘤胃微生物作用和微生态系统，成年健康反刍动物瘤胃微生物理论上可以解决所有的饲料消化与脱毒问题。已经鉴定出瘤胃的分解植物性多聚糖细胞壁的酶有21种之多，这些酶均产自正常功能的瘤胃微生物（White等，1993）。正常情况下，特别是中等生产性能水平、无应激生理状态下，不需要额外添加外源酶制剂。
反刍动物高产是高投入高产出的生产活动，高采食量或者富营养状态，超过了瘤胃本身微生物产酶能力能够完成，或者高负荷的发酵活动，特别是高精料、高谷物、高淀粉性质的日粮，特别容易产生酸中毒，影响瘤胃微生物活性和微生态系统，无法保证瘤胃发酵系统完整性。高产状态下的动物更容易产生应激，影响瘤胃微生物和微生态系统。需要外源微生物或者酶制剂的帮助。反刍动物酶制剂添加的3个前提：一是需要辅助解决保证一定量粗饲料消化问题；二是需要维护和保证瘤胃微生物的生物活性与微生态问题；三是需要解决高产奶牛需要高能量谷物投入容易造成酸中毒问题。
反刍动物饲料酶的复杂性是由两方面决定的。一是反刍动物消化道的复杂性，特别是瘤胃的复杂性。瘤胃是一个天然的“生物发酵与合成反应罐”：能够分解消化大分子营养物质；能够分解脱毒有机有害成分；能够合成营养成分（氨基酸、营养肽、维生素、挥发性脂肪酸等）；产生生物活性成分（酶、功能肽、功能寡糖、后生元等）；能够产生理化影响因子（有机酸、纤维类产物等）。但是，瘤胃也是条件敏感的消化道器官和微生态系统，容易受到日粮成分及本身代谢造成的理化因素的影响。
二是源于反刍动物饲料原料与单胃动物日粮相比的复杂性，体现在物理特性和化学特性两方面。物理特性是饲料原料，特别是粗饲料不同成分的空间结构与嵌合方式和程度等。化学特性是饲料原料同一类成分的组成单位的差异与主链长短及支链分布形式等。
这些复杂性体现在高产奶牛更明显，与一般的肉牛肉羊等反刍动物不同，奶牛高产是一个连续性高投入高产出过程，需要外源手段实现。同时，奶牛一般有消化道疾病和代谢病及利用年限等问题，代谢病容易影响奶牛产奶和产奶周期。日粮不平衡和富营养，特别是高淀粉、高精料日粮，容易影响瘤胃微生物构成和活性，造成微生态系统的紊乱，影响动物健康，影响奶牛的利用年限。
2 反刍动物酶制剂技术体系的构建
传统的单酶和复合酶及其技术体系可能满足单胃动物的需要，无法满足反刍动物的需要。实际上，反刍动物中外源性酶制剂的作用模式是非常复杂的，在这方面需要大量的研究。加拿大农业与农业食品Lethbridge研究中心McAllister等（2001）在讨论反刍动物添加饲料酶制剂时就指出：“学者将来的任务是阐明外源性酶制剂的作用模式，这种作用模式可以是一个，也可以是多种的组合，使得外源性酶制剂能更好地改善饲料效率，增加生长和奶产量”。
多年来，我们一直致力于构建饲料酶制剂的技术体系（冯定远等，2011、2020），但主要是单胃动物基础的饲料酶制剂技术体系。反刍动物饲料酶制剂，特别是奶牛酶制剂需要一个新思路或者新理论，我们构建的这个体系正是由多个作用模式组成，而且不同作用模式是可以组合的。我们提出的反刍动物酶制剂技术体系包括4个作用模式：解决粗饲料消化问题，需要一个多酶系统的集合，可以称之为“集合酶”模式，包括多种酶来源的复合酶、组合酶或者配合酶；保证瘤胃微生态健康，需要一个外源酶与内源菌协同，或者称之为“酶菌同构”模式，包括提供能够产生一些原位益生元的酶制剂，有利于瘤胃微生物的繁殖和活性维护；体外酶制剂粗饲料预处理与日粮精料添加酶在体内起作用结合，体外酶部分解决消化问题，体内酶解决瘤胃微生物营养与微生态问题及消化道健康（特别是酸碱中毒和酮病等），就是“内外酶结合”模式，体外主要是粗饲料如青贮原料的酶处理；四是使用“过瘤胃酶技术”模式，小肠中外源性酶制剂可以通过降低小肠食糜黏度或者水解瘤胃未能消化的底物，从而改善营养物质的吸收，主要是蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，是小肠酶的补充。
我们可以把反刍动物饲料酶制剂技术方案概括为“四位一体、组合运用”，“四位一体”就是都围绕饲料原料与瘤胃微生物互作，通过直接和间接方式，提高瘤胃微生物的作用效率；“组合运用”是4个作用模式可以是单独一个，也可以是2~4个的组合，具体根据动物的种类、发育阶段、生产周期、日粮类型等，例如低产或者停止泌乳的奶牛，使用简单的复合酶或者配合酶就可以了，只有围产期的高产奶牛，才可能需要同时考虑4个模式的酶制剂应用：即粗饲料原料酶预处理+分解复杂原料的酶制剂集合+过瘤胃酶（包被处理）+产生益生元酶制剂（如阿魏酸酯酶等辅效酶）。
反刍动物酶制剂的“粗料酶预处理与精料添加酶结合”方案就是酶制剂处理粗饲料，在精饲料中也使用酶制剂，后者类似单胃动物使用酶制剂，一般是在反刍料TMR加入单酶，或者复合酶、组合酶等，这是目前反刍用酶的一般做法。由于反刍动物使用大量的粗饲料，也可以在粗料中使用酶制剂进行预处理，特别是使用纤维素酶和其他NSP酶，更常见是青贮料使用酶制剂，操作更方便，许多反刍用酶的试验也是酶制剂处理青贮料，并取得良好的效果，提高了干物质、粗纤维的消化率。外源性酶制剂在未被动物采食之前，就已经开始了对饲料的消化，能改善反刍动物瘤胃内的消化，减少下部消化道中饲料的消化率。酶制剂作用效果与其使用方法有关，将酶制剂喷到混合日粮中不能增加奶产量，而应用到精料中则可以增加奶产量（Beauchemin等，1998）。粗料预处理（需要一定的条件，包括处理水分、处理时间等）和精料直接使用是比较合适的措施，简单的粗料与精料混合时使用酶制剂则没有什么效果。
反刍动物酶制剂的“过瘤胃处理酶制剂”方案是考虑一部分营养在消化道后段（小肠）的消化不够充分，而部分酶制剂在瘤胃不能够发挥作用，但在瘤胃中被破坏灭活。通过过瘤胃技术，特别是酶制剂包被技术，让酶制剂到达小肠才释放发挥作用。一般是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。也可以使用一些包被的NSP酶，到小肠降低食糜的黏性，间接改善后段消化道对营养物质的吸收。对于酶改善生产性能的作用，至少一部分是因为对瘤胃或瘤胃后的消化的改变引起的（McAllister等，2001）。“过瘤胃饲料酶制剂”类似单胃动物酶制剂，但又不同。一是协助消化道后段酶消化降解饲料营养；二是降解饲料残留抗营养因子或有害成分；三是协助消化降解瘤胃细菌产生的营养；四是降解瘤胃细菌失活产生“后生元”（postbiotics）。过瘤胃后酶制剂的作用，外源性酶制剂不仅增加了瘤胃中纤维降解活性，而且增加了小肠中纤维的解降活性（Hristov等，1998a，b，2000），这种现象在木聚糖酶活性表现得更为明显，外源性酶制剂的添加增加了十二指肠木聚糖酶的活性约30%（Hristov等，1998a）。
在反刍动物饲料酶制剂技术体系的4个方案中，下面重点讨论“集合酶”方案与“酶菌同构”方案。
3 反刍动物酶制剂技术体系的“集合酶”方案
根据反刍动物的饲料特性、动物生理生产阶段、生产性能需要，把我们提出的饲料酶制剂的单酶、复合酶、组合酶、配合酶等理念（冯定远等，2019）进行集合，作为一个整体考虑，或者是多种解决复杂原料酶制剂方案的一个集合（简称“集合酶”）。“集合酶”不像“复合酶”“组合酶”等是一种产品，而是一种技术方案。特别是把组合酶与配合酶的协同，形成一个集合酶系统，综合考虑饲料物料复杂的物理结构与多样的化学组成，最大程度解决消化的高效问题。
反刍动物对外源性酶制剂的反应，是多因素的综合。常见反刍动物酶制剂，主要是基于降解植物细胞壁而制作的酶，主要是纤维素酶和木聚糖酶。但这些商品酶制剂不是由单一酶构成，不同程度有第二种酶活性（如淀粉酶、蛋白酶、果糖酶）存在，是一种天然的组合酶和配合酶。纤维素和半纤维素的降解需要很多酶，这些商品酶制剂中各种单一酶的相对比例和活性组成不同，会影响其效果。甚至一种微生物，因菌株选择及底物和培养基不同，而产生的酶的类型和活性变化很大（Considine等，1989；Gashe，1992）。根据饲料不同添加相应酶制剂，并非所有酶制剂对消化复杂碳水合物（如紫花苜蓿和大麦）都是同样有效的。对具有过于复杂的结构的饲料原料，过去缺乏关于其限制饲料消化率和饲料消化程度的了解，这使得酶制剂工程设计生产对付抑制饲料消化的酶制剂无从下手，现在情况已经大大改变了。
对有些饲料酶作用的特异靶底物是可以鉴别的，比如在玉米的蛋白中包含着淀粉颗粒，使得淀粉本身的特性（供能）未能发挥出来，限制了其中淀粉的降解（McAllister等，1993）。因此设计的外源性酶应能消化这种蛋白质链矩阵，以释放淀粉颗粒，能够被瘤胃或宿主的内源性酶消化。含有淀粉酶（但不含有蛋白酶）的外源性酶制剂并不能显著提高反刍动物对玉米的利用率（McAllister等，2001）。这就需要我们提出的配合酶（冯定远等，2019），就是在物理空间有特定关联的几种酶制剂的配合，如同时有淀粉酶、蛋白酶等才能完成对玉米的消化利用。对秸秆来说，微生物消化的主要障碍是硅土、蜡质和角质（Bae等，1997），角质酶也可能是一种辅效酶。
4 反刍动物酶制剂技术体系的“酶菌同构”方案
反刍动物作为一类特别的物种，瘤胃是其草食性、耐粗性的基础。不仅能够消化粗纤维、低质蛋白，同时能够利用C、N、H、P、S 等元素合成糖、氨基酸、部分维生素（B族、K等），以及生物活性物质（酶、激素、有机酸等）。瘤胃是一个功能多样、高效的“天然发酵与合成反应罐”。但瘤胃具有的数量众多复杂的菌群和微生态系统，一个流动易变消化器官系统，对物理、化学、生物等条件非常敏感，温度、酸度、渗透压、电解质、有害或者抗营养成分等都会影响发酵合成罐的效率，更严重时影响系统的完整性。基于这两方面，“酶菌同构”的出发点是两个：辅助消化与维护条件，酶制剂帮助消化，减少瘤胃微生物的负担；酶制剂产生有益成分，提供细菌需要成分和维护理化环境。考虑外源酶制剂的辅助性消化，在高投入时微生物消化超负荷时尤其如此；外源酶降解产物为微生物提供营养底物，维系良好的微生物活性与微生态平衡，应用我们提出的主效酶与辅效酶，外源性酶制剂对胃肠道微生物菌落和反刍动物本身均有很多作用。
反刍动物酶制剂技术体系的“酶菌同构”的内容包括3个方面：酶辅助瘤胃微生物消化复杂日粮。通过外源添加酶制剂，协同帮助瘤胃微生物消化功能，特别是高产奶牛高采食量、高营养情况下，有针对性地结合复合酶、组合酶、配合酶，进行外源酶制剂的集合。解决大量、难消化饲料的消化，减轻瘤胃微生物消化的负担。米曲霉的浸提物与瘤胃微生物浸提液协同提高从干草中释放的可溶性糖量（Newbold，1995）。已经证实阿拉伯木聚糖与p-香豆酸基和阿魏酸基的交叉连接程度，是限制植物细胞壁消化的一个因素（Hatfield，1993），米曲酶可以产生一种酯酶，这种酯酶能打破p-香豆酸和阿魏酸与阿拉伯木聚糖之间形成的酯桥（Tenkanen等，1991），这与瘤胃微生物在功能上有协同作用（Varel等，1993）。实验室培养的细菌可能有几种瘤胃纤维素分解菌（如梭菌属、瘤胃球菌）（Forster等，1998）。这些正是产生消化植物细胞壁必须具有的不同酶活性所需要的微生物。外源性酶制剂可以增加瘤胃纤维消化率和总胃肠道纤维消化率，这进一步证实了上述作用（Yang等，1999）。特别是难消化饲料、高纤维日粮更明显，外源性酶制剂改善了饲喂大麦日粮的奶牛饲料转化率，而没有改善饲喂玉米日粮饲料转化率，这是因为大麦的纤维含量高（Beauchemin等，1997）。瘤胃中外源性酶制剂可直接作用于饲料，也可以通过与瘤胃微生物的协同作用间接刺激消化活性（McAllister 等，2001）。
酶调节瘤胃理化环境。维持瘤胃的良好的理化环境非常重要，特别是使用高精料时，淀粉类在异常发酵情况下，容易产生酸中毒。淀粉酶、糖化酶等，让可溶性糖水解直接吸收（如葡萄糖），减少淀粉类发酵产生丙酸、乳酸等，影响瘤胃作为天然发酵罐的功能，酸中毒影响微生物的活性，也影响瘤胃组织功能，对于需要维持比较长的利用年限的奶牛特别重要（相对而言，肉牛、肉羊考虑比较少）。对于高浓度的低纤维日粮而言，纤维分解酶显著改善了饲喂高谷物日粮的牛的饲料消化率（Krause等，1998）和生产性能（Beauchemin等，1997；Iwaasa等，1997）。对此种现象的解释，在于比较瘤胃生物产生的纤维分解酶需要的最佳pH环境，和由厌氧性真菌产生的纤维分解酶所需要的最佳pH环境。pH低于6.2时，抑制纤维分解菌的生长（Russell等，1980），纤维消化率大大降低（Hoover等，1984）。许多瘤胃微生物本身功能产生的纤维分解酶的最佳pH超过了6.2（Greve等，1984；Matte等，1992）。如果外源酶制剂与瘤胃微生物有协同作用，则更能提高瘤胃对纤维的消化。表明外源性酶制剂具有媒介活性，这种活性在降解植物细胞壁上受到瘤胃微生物的限制。植物细胞壁在瘤胃内的消化受到限制可能是因为瘤胃微生物所产生的酶的类型和量不足、降解酶不能与底物很好地互作或者瘤胃中的状况并非酶发挥作用的最佳条件（如瘤胃pH过低等）。
酶产生微生物需要的益生元。单胃动物方面，外源酶制剂影响仔鸡肠道菌群发生了变化（Hock等，1997；Vahjen等，1998）。部分酶产物成为瘤胃微生物的益生元，酵母细胞壁是近年来在反刍动物特别是奶牛应用比较多的产品，其中一个重要作用是提供瘤胃微生物需要的营养底物。酶制剂具有益生功能，我们专门提出了“益生型酶制剂”的理念（冯定远等，2020），就是酶制剂的降解产物，部分可以作为肠道微生物的益生元，调节肠道健康和微生态正常。这方面真正有重要价值的是在反刍动物肠道微生物，特别是瘤胃的细菌营养底物，米曲霉的浸提物能增加瘤胃细菌的数量（Newbold等，1992a，b）。木聚糖酶能够将日粮的木聚糖原位产生瘤胃细菌需要的益生元（主要是木寡糖），但是一些复杂的木聚糖，特别是玉米等来源的木聚糖，由于含有支链或者侧链，影响了木聚糖酶发挥作用，需要使用一些我们称之为“辅效酶”的酶制剂，如阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶，与主效酶（木聚糖酶）配合，才能降解木聚糖酶，产生细菌需要的益生元。这些已被雷钊（2017）和郑达文（2019）在单胃动物试验所证实。生物技术进展很快，纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶等已被广泛应用，但是我们提到的反刍动物酶制剂技术体系其他重要的酶，如阿魏酸酯酶、角质酶、乙酸基木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶等“辅效酶”还没有被充分认识。
反刍动物饲料酶制剂技术体系除了以上4方面方案外，还需要有特别的评价体系，特别是多年生产的奶牛，与一般单胃动物不同，不能仅仅考虑常规的生产性能指标，还需特别注意兼顾瘤胃健康、消化道健康和整个动物机体的健康，减少酮病等代谢类疾病。以奶牛为例，评价饲料酶制剂效果的指标应该包括两方面：一是生产性能，包括产奶量、牛奶质量、饲料效率；二是健康与利用年限，包括瘤胃微生物生物量与活性、代谢病指标、奶牛产奶周期与利用年限等。其中一个指标明显就是有价值的奶牛饲料用酶，至于经济价值就需要考虑酶制剂的成本了。
总之，反刍动物瘤胃消化道的特点和复杂性（如有很多微生物菌落，能产生很多内源性酶制剂），使得外源酶制剂在反刍动物体内的作用机制更加复杂。必须考虑酶作用的靶底物，设计特异的复合酶，或者组合酶、配合酶，甚至是各种酶、各类酶的集合，并且是依据特定粗料、干草、目标底物的成熟程度以及结构性障碍而设计，特别考虑外源酶对体内酶特别是瘤胃微生物酶的补充、外源酶产生原位益生元维持瘤胃微生态、多种形态酶制剂的集合解决的复杂饲料原料消化、大体积粗饲料的酶预处理结合精饲料的酶制剂添加、过瘤胃技术让部分酶制剂在瘤胃后段肠道发挥功效等作用模式。提出有别于单胃动物的反刍动物饲料酶制剂技术体系，就是基于反刍动物瘤胃的复杂性和粗饲料的粗劣性，该体系包括4个作用模式：“体外酶预处理与体内添加酶结合”“过瘤胃酶处理”“集合酶”“酶菌同构”方案。这些方案“四位一体、组合运用”，这些作用模式及技术方案并不需要同时考虑，在不同条件下可以组合，同时，施加了这些方案也不一定达到期望的生产效果，这是一种潜力和可能性，高产奶牛的产奶前期应用效果更明显。
参考文献及更多内容详见：饲料工业，2022，43（7）：1-8
作者简介
冯定远，华南农业大学教授、博士生导师，农业农村部饲料评审委员会委员、全国饲料标准化委员会委员，中国动物营养学会常务理事，中国饲料工业协会常务理事，广东省饲料行业协会名誉会长，广州市饲料行业协会荣誉会长。华南农业大学毕业后留校任教，从事动物营养与饲料科学的科研教学及研究生培养工作，重点研究领域在饲料生物技术和饲料营养价值评定，在饲料酶制剂领域有较深入的研究，出版“饲料酶制剂技术体系”专著两部。
